在完成膠質瘤組織樣本的初步處理后，接下來的實驗步驟需嚴格遵循無菌操作規范，以確保細胞的活性和實驗數據的可靠性。
將消化后的組織懸液通過100μm細胞篩過濾，以去除未充分消化的組織塊和纖維成分。濾液收集至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清，加入適量預冷的PBS重懸細胞，再次離心洗滌，重復兩次以清除殘留的消化酶和碎片。
隨后，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基重懸細胞沉淀，輕柔吹打至均勻單細胞懸液。將細胞懸液接種于預先包被多聚賴氨酸的培養皿中，置于37℃、5% CO?的培養箱中靜置培養。24小時后更換新鮮培養基，去除未貼壁的死亡細胞和雜質。
為促進膠質瘤源細胞的富集，可采用差速貼壁法進一步純化。由于成纖維細胞貼壁速度較快，可在接種1-2小時后將未貼壁的細胞懸液轉移至新的培養皿，重復此步驟可降低間質細胞污染。此外，若需分離特定亞群，可使用CD133或EGFR等表面標記物通過流式分選或免疫磁珠法進行篩選。
培養期間需每日觀察細胞形態和增殖狀態。原代膠質瘤細胞通常呈梭形或不規則多邊形，聚集成簇生長。若出現過度分化或污染，需及時進行抗生素處理或重新分離。待細胞融合度達80%時，可進行傳代或凍存。傳代時建議使用低濃度胰酶（0.05%）短時消化，避免損傷細胞膜完整性。
后續實驗可根據研究方向設計功能驗證，如侵襲實驗、藥物敏感性測試或基因編輯。注意每次操作前需進行細胞鑒定（如免疫熒光檢測GFAP、Nestin等標志物），確保實驗結果的準確性。
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